马铃薯和拟南芥GAPC酶基因的克隆及分析 | 蔬菜好營養
![马铃薯和拟南芥GAPC酶基因的克隆及分析](https://i.imgur.com/4LfH9YV.jpg)
胞质三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPC)是糖酵解中的关键酶,近年的研究表明其对盐、低温、高温、氧化、高渗、低磷等多种逆境胁迫均有响应。本实验采用RT-PCR,分别从马铃薯和拟南芥中 ...
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野生型拟南芥种子(Columbia生态型),由四川农业大学玉米研究所张素芝教授提供。马铃薯栽培型品种米拉,由四川农业大学农学院马铃薯研究开发中心提供。植物表达载体pBI121由四川农业大学李立芹副教授惠赠,克隆载体pMDTM19-T Simple Vector(TaKaRa)购自宝生物公司。
1.2 方法1.2.1 AtGAPC2和 StGAPC基因的克隆
实验于2010年10-12月在四川农业大学农学院马铃薯研究开发中心完成,分别取拟南芥和马铃薯幼苗叶片100 mg,采用Trizol法提取总RNA,以40 μL DEPC(diethyl pyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)处理水溶解。反转录合成cDNA第一链,体系为20 μL,在用DEPC处理过的无菌0.2 mL PCR管中依次加入:oligo dT 1 μL,RNA 3 μL,DEPC处理水8 μL,轻微混匀并离心30 s,65℃变性5 min,冰上急冷2 min,按序加入5×Reaction Buffer 4 μL,RNase 抑制剂 (20 U/μL) 1 μL,10 mmol/L dNTP Mix 2 μL,反转录酶 (200 U/μL) 1 μL。轻微混匀稍离心,42℃,60 min,72℃ 10 min终止反应。以第一链为模板,PCR扩增目的片段,根据NCBI上公布的 AtGAPC2(拟南芥)和 StGAPC(马铃薯)的CDS全长序列(Accession No. AY090275,AF527779),用Oligo 6软件分别设计引物并引入 XbaⅠ、 SmaⅠ酶切位点。
AtGAPC2 P1:5 TCTAGAATGGCTGACAAGAAGATCAGAAT3,P2:5 CCCGGGTTAGGCCTTTGACATGTGAACG3。
StGAPC P1:5 TCTAGAATGGCCAATGGCAAGATCAAAAT3,P2:5 CCCGGGTCAAGCCTTGGCCATAT3。
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